Стратегии терапии глиом с мутацией ТР53

TP53

ТР53 (опухолевый белок р53) — это ген, кодирующий белок р53. Белок р53 – это транскрипционный фактор, ответственный за контроль над повреждением ДНК. Он может инициировать арест клеточного цикла или апоптоз (вид клеточной гибели), что зависит от глубины повреждения, и таким образом известен как опухолевый тормоз (ген и белок, уменьшающие вероятность появления злокачественных клеток). Следует отметить, что ТР53 является наиболее часто изменяющимся геном при раке у человека — известно, что около 50% человеческих опухолей несут одну или более мутаций в гене ТР53. Точечные мутации в гене ТР53 приводят к образованию измененных белков р53, которые не только подавляют нормальную транскрипционную активность р53, но также вызывают развитие новых про-опухолевых функций. Из-за этого мутации ТР53 считаются «мутациями приобретения функции» (gain-of-function), при которых функция сдерживания опухолевых процессов теряется, а вместо неё приобретается обратная — опухоль-развивающая.

Почти все случаи астроцитомы с мутацией гена IDH несут также мутации ТР53 [1], тогда как среди глиобластом мутацию ТР53 содержат около 34% [2]. Известно, что 95% точечных мутаций ТР53 встречаются в ДНК-связывающем домене [3], включая наиболее частые мутации, найденные в астроцитомах и глиобластомах: R273C (самой частой в IDH-мутантных астроцитомах), R273Н (самой частой в астроцитомах и глиобластомах с IDH дикого типа) и R175Н. Олигодендроглиомы, кроме редких случаев, не содержат мутаций ТР53.

Термин «gain-of-function» дословно переводится как «прирост, приобретение функции», но в генетическом контексте это некорректно — в результате мутации функция не столько «прирастает», сколько извращается. Как правило, такие мутации доминантны, поскольку мешают олигомеризоваться и функционировать белку, в том числе, считанному с нормальной копии гена, и даже приводят к накоплению конгломератов белка в цитоплазме. Нередко к аналогичному эффекту в эксперименте или в результате мутации (напр., дупликации) приводит гиперэкспрессия какого-то белка. Видимо, термин «gain-of-function» ввели по принципу антонима к loss-of-function (мутация, приводящая к потере белком его функции). Эффект от такой мутации подобен эффекту от гиперэкспрессии, хотя «gain-of-function» может быть и точечной мутацией. Мутация типа «gain-of-function» вызывает, как правило, более тяжелые изменения в фенотипе, чем мутация loss-of-function.

p53 и цинк

Белок р53 включает один ион цинка в ДНК-связывающий домен и это количество цинка необходимо для обеспечения правильной формирования и функционирования р53. Многие мутантные р53 белки склонны к потере этого иона цинка, что приводит к сбою в процессе синтеза и потере функции синтезируемого белка [3]. Роль этой потери цинка была показана в эксперименте путем его удаления хелатными агентами, что приводило к потере нормальной функции белка р53, которую тем не менее можно было восстановить при добавлении цинка. Многие мутации гена ТР53 в ДНК-связывающем домене  могут изменять процесс формирования белка, а также воздействовать на связывание цинка с белком. Эти наблюдения навели исследователей на мысль о том, не может ли дополнительное введение цинка положительно воздействовать на функцию р53 в р53-мутантных линиях раковых клеток [3].

В исследовании [3] концентрации цинка в 100 микромоль показали восстанавливающее действие на опухолевые клетки с мутантным р53. Добавление цинка к клеткам рака молочной железы, имеющим мутацию ТР53 R175Н и клеткам глиобластомы U373 (с мутацией ТР53 R273Н), вызвали повышение клеточной гибели при воздействии на них химиопрепаратов цисплатина и адриамицина (доксорубицина). В этих же линиях цинк вызывал повышение иммуногистохимического окрашивания на активный (свернутый) р53 и снижал — на денатурированный (развернутый) р53. Добавление цинка также восстанавливало нормальную транскрипционную активность мутантного р53, как например, его связывание с промоутерами р21 и BAX, что приводило к аресту клеточного цикла и апоптозу (гибели опухолевых клеток). Более того,  цинк подавляет онкогенные функции мутантного р53, такие как образование р53/р73 комплексов, которые мешают осуществлению апоптотической функции р73.

Чтобы определить, могут ли р53-восстанавливающие свойства цинка быть перенесены на модель in vivo, клетки глиобластомы  U373 (с мутацией ТР53 R273Н) вводили бестимусным (лишенным собственного иммунитета, без вилочковой железы) мышам. После образования опухоли мышам перорально вводили 10 мг цинка на 1 кг массы в день в течение 2-х недель, или проводили лечение цисплатином, или комбинацией обоих веществ.  Через 14 дней объемы опухолей у мышей, леченых цисплатином с цинком, были на 30% меньше, чем у мышей, получавших только цисплатин. Введение одного цинка не оказывало тормозящего действия на опухолевый рост. Более того, при исследовании этих опухолей отмечено, что после дополнительного введения цинка повышалась положительная реакция на функционально активный р53, а положительная реакция на денатурированный р53 снижалась, что показывает частичное восстановление правильной конформации (синтеза) и функции р53.

Разрушение мутантного р53 после добавления цинка происходит при участии аутофагии

В дальнейшем исследовании, выполненном той же группой (автор для переписки Gabriella D’Orazi, University “G. d’Annunzio” Chieti, Italy) проведено изучение эффектов воздействия цинка на опухолевые клетки с мутантным р53 [4]. В этой работе конъюгат (молекула, через которую связываются вместе две другие различные молекулы) цинк-куркумин применялся для достижения такого же эффекта восстановления функции мутантного р53 в опухолевых клетках, как в предыдущих работах, где использовали хлорид цинка. В предыдущих исследованиях показана способность цинка восстанавливать функции мутантного р53; в новой работе внимание фокусируется на способности конъюгата цинка снижать уровни мутантного р53 в клетках SKBR3 рака молочной железы человека (ТР53 R175Н). Было обнаружено, что разрушение мутантного р53 после взаимодействия с цинком, зависит от аутофагии, а ее химическое подавление 3-метиладенином или хлорохином (антималярийный препарат, блокирующий аутофагию) предотвращало цинк-индуцированное разрушение мутантного р53. Генетический нокдаун гена ATG5, необходимого для аутофагии, также полностью предотвращал разрушение мутантного р53, что подтверждает роль аутофагии в этом процессе. Более того,  было обнаружено, что после добавления конъюгата цинка, р53 с уже восстановленной функцией индуцировал различные белки, связанные с аутофагией.

Дальнейшие эксперименты показали, что ингибирование аутофагии хлорохином предотвращало восстановление нормального р53 в р53-мутантных клетках опухоли SKBR3. Авторы резюмировали эти находки следующим утверждением: «Таким образом, гипотеза о том, что добавление цинка реактивирует функцию р53 дикого типа путем воздействия на сворачивание большинства (но, похоже, что не всех) мутантных р53 белков внутри клетки, что затем вызывает разрушение оставшихся мутантных р53 белков путем р53-индуцированной аутофагии… В общем эти данные означают, что ингибирование аутофагии представляет препятствие для способности Zn(II)-curc (конъюгат цинк-куркумина) полностью реактивировать мутантный р53 R175Н… Эти же данные предостерегают от применения ингибиторов аутофагии в качестве противоопухолевых средств, особенно в плане опухолей, несущих р53- R175Н мутацию».

Для иммуногенного эффекта химиотерапии в опухолевых клетках с мутантным р53 требуется добавление цинка

Другая работа [5], выполненная этой же итальянской группой ученых, была посвящена необходимости применения цинка для вызова иммунного ответа и созревания дендритных клеток после химиотерапии клеточных линий с мутантным р53. Зрелые дендритные клетки необходимы для генерации эффективного противоопухолевого ответа. Авторы культивировали вместе незрелые дендритные клетки с р53-дефицитными клеточными линиями (ADF) или р53-мутантными линиями глиобластомы (U373) и инкубировали эти клетки с химиопрепаратами (цисплатином, адриаммицином/доксорубицином) с добавлением и без добавления 100-микромолярных концентраций цинка. Было обнаружено, что добавление цинка необходимо для созревания дендритных клеток в комбинации с химиотерапией.

Кальретикулин — это белок, который транслоцируется на поверхность клетки после стресса эндоплазматической сети, что служит опасным для клетки сигналом ее разрушения иммунной системой; процесс известен как «иммуногенная клеточная гибель». Добавление цинка к культурам р53-дефицитных или мутантных клеток существенно повышает присутствие кальретикулина на поверхности клеток при химиотерапии или без нее. Эта индуцированная цинком транслокация кальретикулина на поверхность клеток сопровождалась активацией аутофагии. При добавлении в культуру ингибитора кальретикулина сочетание химиопрепаратов и цинка не смогло активировать дендритные клетки, культивированные вместе с р53-дефицитными опухолевыми клетками, что показывает важность действия кальретикулина для активации дендритных клеток.
Напротив, когда опухолевые клетки с нормальным белком р53 инкубировали с доксорубицином и кальретикулин транслоцировался на поверхность клетки, это не препятствовало созреванию дендритных клеток, так как для этого клеткам с нормальным р53 цинк не нужен. Этот эксперимент показал, что необходимость цинка для развития иммуногенной клеточной гибели при химиотерапии является особенностью р53-дефицитных или р53-мутантных клеток. Предыдущие исследования [6] показали, что аутофагия необходима для высвобождения АТФ — еще одного необходимого компонента для развития иммуногенной клеточной гибели. Одна из функций р53 – инициация транскрипции генов, связанных с аутофагией, таких как DRAM (модулятор, регулирующий разрушение ДНК путем аутофагии). Очевидным является предположение, что добавление цинка позволяет инициацию аутофагии в ответ на введение доксорубицина и цисплатина, а также последующее высвобождение АТФ, образуя иммуногенный сигнал с дальнейшим созреванием дендритных клеток, и это происходит путем восстановления нормальной функции мутантного или дефектного р53. Механизм транслокации кальретикулина на поверхность после добавления цинка к р53-дефицитным клеткам неизвестен. Прежние работы [6] показали, что аутофагия не влияет на такую транслокацию кальретикулина.

24 октября 2015 года

В значимом новом исследовании показано, что уровень металлотионеинов повышен у больных глиобластомой с короткой продолжительностью жизни. Металлотионеины — это класс внутриклеточных белков, связывающих тяжелые металлы, которые могут связывать 7 атомов цинка на 1 молеклу металлотионеина. Поразительной находкой было то, что как U251 (мутантный р53), так и U87 (дикий тип р53) клеточных линий глиобластом чаще были положительными в тестах на развернутый мутантный р53 белок, а в линии U87 уровень металлотионеина 3 (МТ3) был в целых 4 раза выше. Это предполагает, что цинк-связывающая активность металлотионеинов приводит к развёртыванию конформации мутантного р53 в клетках U87, даже в отсутствии мутации ТР53. Более того, добавление цинка отменяло такую схему in vitro, повышая уровень р53 с нормальной конформацией, и снижая уровень белков с р53 мутантного типа (развернутых и неактивных). Это очевидно указывает на потенциальную полезность введения цинка как в случае р53-мутантных, так и р53-немутантных опухолей.

Высокий уровень металлотионеинов прогнозирует плохую выживаемость при мультиформной глиобластоме: High metallothionein predicts poor survival in glioblastoma multiforme.

Дозирование цинка

Как сказано на сайте examine.com, «…подтверждается, что цинковая нагрузка путем приема до 100 мг цинка в день  в течение недолгого времени (2-4 мес.) безопасна, но, поскольку эта доза выше 40 мг ПДУ (предельно допустимого уровня) цинка, длительное введение ее не рекомендуется. Пероральное поступление цинка затрудняется другими минеральными продуктами, включая «Кальция-Д-Глюкарат», «Магнезия» и «Железа» (БАД), т.к. все они используют один транспортер. Если предельное поступление транспортера (800 мг) превышено при применении этих четырех минеральных продуктов, скорость всасывания будет снижаться. При применении меньшей суммарной дозы, чем 800 мг, всасывание происходит хорошо».

Мутантный p53 и депривация глюкозы

В работе [7], опубликованной в 2012 г. в журнале Cell Cycle группой из Университета Джорджтауна (Вашингтон, округ Колумбия) очевидно показано, что накопление мутантного белка р53 можно подавлять жестким ограничением углеводов в диете, что приводит к значительному угнетению опухолевого роста у мышей с р53-мутантными опухолями.
Сначала авторами было показано, что экспрессию мутантных белков р53 можно ингибировать in vitro путем снижения концентрации глюкозы в культуральной среде. Напротив, снижение концентрации аминокислот и сыворотки не влияло на экспрессию мутантного р53. Было обнаружено, что ингибирование накопления мутантных белков р53 после ограничения глюкозы происходит скорее вследствие разрушения белка путем аутофагии, чем проявления активности протеасом.

Возможность поломки мутантного р53 при ограничении глюкозы тестировали также на мышах. Трансгенных мышей с мутантным (р53 A135V) и диким типом р53 рандомизировали по одной из трех диет: обычной, низкоуглеводной и высокоуглеводной. Низкоуглеводная содержала 74% белков, 24% жиров и 2% углеводов по калорийности или 71,1% белков, 10% жиров и 1,9% углеводов по массе  (остальное представлено волокнами, витаминами, минералами). По калорийности стандартная и высокоуглеводные диеты содержали 53% и 69% углеводов, 20% и 17% белков соответственно.

Исследование крови показало, что у мышей, бывших на низкоуглеводной диете, снижался уровень глюкозы: около 100 или <100 мг/дл против 130 мг/дл у мышей на стандартной диете. Через 4 мес.мышей забили. Обращает на себя внимание, что уровень мутантного р53 снижался в молочных железах, яичниках и жировой ткани в группе р53 мутантных, находящихся на низкоуглеводной диете мышей. Наоборот, р53 дикого типа стабилизировался в группе дикого типа р53, получавшей низкоуглеводную диету. Дальнейшие исследования проводили для определения влияния ограничения углеводов на рост опухолей. Мышей кормили либо стандартным кормом, либо низкоуглеводной диетой в течение 2-х недель, затем им перевивали клетки рака молочной железы, содержащие мутантный р53 (G242A), дикий р53 или сниженный уровень р53 (р53 отрицательные). Через 3-4 недели измеряли объем опухолей. Среди мышей, находившихся на стандартной диете, наибольшие объемы опухолей были у р53 мутантных, затем у р53 отрицательных. Опухоли были самыми маленькими при диком типе р53. Низкоуглеводная диета эффективно ингибировала рост опухолей во всех трех группах, но особенно значительно – в  р53 мутантных и р53 отрицательных.

В удаленных опухолях определяли уровень р53. В соответствии с результатами работ, выполненных in vitro, низкоуглеводная диета стабилизировала р53 в группе, где он был дикого типа, и ингибировала мутантный р53 в группе, где он был мутантный. Эти данные соответствуют результатам прежних работ выполненных различными группами авторов, в которых показано, что ксенографты колоректального рака с нокаутированным р53 ингибировались при лечении метформином, тогда как такие же ксенографты с нормальной экспрессией р53 были к нему полностью резистентны [8]. Метформин – антидиабетический препарат, который снижает и стабилизирует уровни глюкозы в крови.

 

Ссылки

1.    Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Suzuki et al. 2015.
2.    The Somatic Genomic Landscape of Glioblastoma. Brennan et al. 2013.
3.    Restoring p53 active conformation by zinc increases the response of mutant p53 tumor cells to anticancer drugs. Puca et al. 2011.
4.    Degradation of mutant p53H175 protein by Zn(II) through autophagy. Garufi et al. 2014.
5.    Zinc supplementation is required for the cytotoxic and immunogenic effects of chemotherapy in chemoresistant p53-functionally deficient cells. Cirone et al. 2013.
6.    Premortem autophagy determines the immunogenicity of chemotherapy-induced cancer cell death. Martins et al. 2012.
7.    Dietary downregulation of mutant p53 levels via glucose restriction: mechanisms and implications for tumor therapy. Rodriguez et al. 2012.
8.    Systemic treatment with the antidiabetic drug metformin selectively impairs p53-deficient tumor cell growth. Buzzai et al. 2007.

Реклама

Добавить комментарий

Заполните поля или щелкните по значку, чтобы оставить свой комментарий:

Логотип WordPress.com

Для комментария используется ваша учётная запись WordPress.com. Выход /  Изменить )

Google photo

Для комментария используется ваша учётная запись Google. Выход /  Изменить )

Фотография Twitter

Для комментария используется ваша учётная запись Twitter. Выход /  Изменить )

Фотография Facebook

Для комментария используется ваша учётная запись Facebook. Выход /  Изменить )

Connecting to %s